开云(中国)Kaiyun·体育官方网站-登录入口Piezo1的抒发卓绝高（图4A）-开云(中国)Kaiyun·体育官方网站-登录入口

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骨骼是一种动态组织，通过两种衔尾浮松的进程束缚自我重塑：骨变成和骨接纳。为了推动骨再生医学的发展，线路骨再生的细胞和分子机制被合计是至关进击的。尽管力量不错将参数传递给参与免疫相干活动的细胞，但在骨骼重建本领，免疫细胞处于压力和负荷之下，它们在免疫中的扮装尚未被满盈分析。巨噬细胞是多功能的免疫系统细胞，关于机械刺激引导的代谢禁止至关进击。Piezo1是一种非选拔性钙通谈，抒发在多种组织中以传递机械信号。在这里，使用细胞张力模子征询机械拉伸对巨噬细胞表型转移卓绝机制的影响。选择曲折共培养系统探索巨噬细胞激活对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的影响，以及使用跑步机跑步模子来考据体外征询的体内机制。巨噬细胞检测到的机械应变通过Piezo1导致p53的乙酰化和去乙酰化。这一进程简略使巨噬细胞极化为M2型，并分泌转移孕育因子-beta（TGF-β1），随后刺激BMSCs的迁徙、增殖和成骨分化。敲低Piezo1拦截了巨噬细胞向建造表型的转移，从而影响骨骼重塑。阻断TGF-β I、II型受体和Piezo1显耀裁汰了通顺增多的小鼠骨质地。总之，作家展示了机械张力通过Piezo1引起钙内流、p53去乙酰化、巨噬细胞极化为M2型和TGF-β I开释。这些事件辅助BMSC成骨。

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1.机械张力引导巨噬细胞极化

先前的体外实验也曾讲明M2型巨噬细胞不错引导间充质干细胞（MSCs）成骨细胞分化。作家冷落假定，机械张力将刺激M2型巨噬细胞转移，促使骨髓间充质干细胞（BMSCs）启动成骨进程。使用Phalloidin对巨噬细胞在机械拉伸前后进行染色。跟着加快期的蔓延，巨噬细胞上出现了更多的伪足，标明存在更多的M2型巨噬细胞。为了征询巨噬细胞对张力的极化反映，行使Western blot分析M1和M2极化巨噬细胞的比例（图1B）。流式细胞术分析自满，应力改变了巨噬细胞的表型（图1C）。M2型巨噬细胞在第二小时的增多更为显耀。这些扫尾标明，张力以时刻依赖性神情导致巨噬细胞极化为M2型，张力的后果在2小频繁变得愈加较着。因此，选拔2小时看成进一步征询的时刻点。

图1. 机械张力引导巨噬细胞极化

2. 张力下的巨噬细胞条款培养基促进了BMSCs的增殖和迁徙

为了熟悉巨噬细胞养殖的培养基对BMSCs迁徙是否有影响，作家将BMSCs和巨噬细胞进行了曲折共培养（图2A）。扫尾自满2小时的张力具有最大的迁徙后劲（图2B），各处置组的BMSCs均自满出显耀更高的增殖后劲，其中2小时张力的扫尾最高（图2C-D），自满出比对照组BMSCs更大的侧向迁徙才略（图2E）。鉴于此，受到压力的RAW 264.7细胞的条款培养基显耀增多了BMSCs的迁徙，标明它可能通过增强干细胞归巢对组织愈合产生积极影响。

图2. 张力下的巨噬细胞条款培养基促进了BMSCs的增殖和迁徙

3.巨噬细胞养殖的培养基促进BMSCs的成骨分化

为了征询巨噬细胞免疫反支吾成骨分化的影响，BMSCs在不同本领张力条款下的巨噬细胞条款培养基中被引导分化为成骨细胞。在2小时拉伸组中，BMSCs的成骨后劲显耀增多（图3A-B）。2小时组的矿化进程显耀高于对照组（大致两倍）。与矿化进程一致，2小时拉伸刺激的BMSCs条款培养基中Col1、Runx2、Osx和Opn的成骨mRNA和卵白抒发水平显耀上调（图3C-D）。凭证上述发现，2小时的拉伸可能通过禁止免疫环境中M2型巨噬细胞的极化来促进成骨。

图3. 巨噬细胞养殖培养基促进骨髓间充质干细胞成骨分化

4. Piezo1关于机械力引导的M2型极化是必需的

为了详情为什么施加应力会影响巨噬细胞的极化，作家检测了钙离子信号。钙离子的荧光强度跟着施加张力的时刻而变化，在2小频繁钙离子的广宽内流。然后作家检测了巨噬细胞中的钙相干离子通谈，发现与其他通谈比拟，Piezo1的抒发卓绝高（图4A）。因此作家假定，张力引导的巨噬细胞极化与Piezo1介导的钙内流密切相干。并基于Piezo1抒发水平的数据库，在Piezo1敲低后，发现了p53信号通路（图4B）。细胞免疫荧光自满，与对照组和其他时刻点比拟，张力施加后1小时乙酰化p53的荧光强度颠倒高（图4C）。此外，敲低Piezo1后增多了乙酰化p53的抒发（图4E）。由于乙酰化p53与iNOS的变化一致，作家思知谈Piezo1的穷乏是否会改变巨噬细胞的极化。扫尾标明，在Piezo1激活组中确实统统的巨噬细胞王人是M2型，而Piezo1敲低组中iNOS的抒发确实是对照组的一半（图4F-G）。因此，合计Piezo1关于巨噬细胞向M2表型的转变是必不成少的。

图4. 机械引导的M2极化需要Piezo1

5. 敲低Piezo1梗阻了BMSCs的增殖、迁徙和成骨分化

Yoda1先前已被详情为Piezo1的特异性兴奋剂，在向培养基中添加1 μL/mL的Yoda1并施加2小时的机械张力后，不雅察到巨噬细胞中钙离子内流显耀增多（图5A）。此外，BMSCs的迁徙和增殖与钙离子内流的扫尾相匹配。在Piezo1敲低后，巨噬细胞的条款培养基对BMSCs的影响很小（图5B-C）。作家进一步查验了BMSCs的成骨分化才略。Piezo1过抒发后，巨噬细胞的上清液大大增多了BMSCs的成骨才略。违犯，在巨噬细胞透露于2小时的张力后，敲低Piezo1对条款培养基中的BMSCs影响很小（图5D-F）。总体而言，Piezo1关于机械力的传递至关进击，以至调遣机械张力是否简略影响巨噬细胞极化，进而影响BMSCs的迁徙、增殖和成骨分化。

图5. 敲低Piezo1拦截了骨髓间充质干细胞的增殖、迁徙和成骨分化

6. M2型巨噬细胞通过分泌TGF-β1促进BMSCs的成骨分化

以上扫尾标明，Piezo1导致巨噬细胞极化为M2型，这一进程影响了BMSCs的迁徙、增殖和成骨。巨噬细胞极化后产生的TGF-β1和其他细胞因子对BMSCs的成骨有影响。作家评估了张力下巨噬细胞分泌TGF-β1的抒发，扫尾自满，在2小频繁机械张力简略刺激TGF-β1的分泌。在不同的处置组中，BMSCs在添加不同剂量的TGF-β1抗体到曲折共培养系统后12-48小时进行的CCK8实验中自满出增殖后劲的裁汰（图6C），用0.5ug/ml TGF-β1抗体处置的BMSCs具有最低的迁徙才略（图6D），TGF-β1抗体诊疗显耀裁汰了BMSCs的成骨抒发（图6E-F）。因此，作家得出论断，机械张力导致巨噬细胞极化为M2型并开释TGF-β1，反过来不错促进BMSCs的迁徙、增殖和成骨分化。

图6. M2巨噬细胞通过分泌TGF-β1促进骨髓间充质干细胞成骨分化

7. 使用TGF-β受体I、II拦截剂或Piezo1拦截剂处置的小鼠推崇出较差的骨骼重塑

骨骼变成是一个触及骨骼和免疫系统之间相互作用的复杂进程。为了征询Piezo1和TGF-β1在骨骼再生中的作用，作家开发了一个跑步模子。辩别打针水、Piezo1拦截剂（GsMTx-4）或TGF-β受体I、II拦截剂（LY-364947）。跑步显耀增多了小鼠的骨质地，但当Piezo1被拦截时，机械力传递也被阻断，打针GsMTx-4的小鼠骨质地确实与对照组（即不跑步组）是疏通的。巨噬细胞开释的TGF-β1在TGF-β受体I、II被阻断后未能证据作用，导致小鼠胫骨严重骨建造不良（图7A）；跑步组的骨小梁数目显耀增多（图7B）；跑步大大培植了F4/80阳性巨噬细胞分泌的TGF-β1，但Piezo1拦截剂显耀拦截了这一效应（图7C）。因此，Piezo1的拦截大幅裁汰了巨噬细胞分泌的TGF-β1，从而减少了通顺引起的体内骨质地增多。

图7. TGF-β1和Piezo1的敲低均可裁汰跑步小鼠的骨重塑

图8. 机理图

论断

总之，作家发现机械力通过Piezo1介导的变化，影响了钙离子内流、p53的乙酰化和去乙酰化，引导巨噬细胞极化为M2型，分泌TGF-β1，并促进BMSCs的成骨作用（图8）。这一发现标明，Piezo1介导的巨噬细胞机械信号传导是骨免疫学的基础。它为将来的临床骨创伤、骨质疏松症和骨牵引诊疗提供了足迹。

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发布于：安徽省